Sigara Dumanına Maruz Kalan Sıçanlarda Aortanın Histopatolojik Değişiklikleri ve Element İçerikleri
Mustafa
Cihat AVUNDUK*, Serdar YARDIMCI**, Kadirhan SUNGURLUOĞLU***, Levent KURNAZ****,
Cem KOÇKAR*****, Tuncay DELİBAŞI*****
* Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı, KONYA
** Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı,
*** Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı,
**** Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Biyokimya Anabilim Dalı,
***** Ankara Numune Hastanesi, İç Hastalıkları Kliniği, ANKARA
ÖZET
Sigara dumanının sıçan aortalarında oluşturduğu histopatolojik değişiklikleri ve element içeriğini araştırmak için deney grubu hayvanlara 90 gün boyunca, günde bir saat 1/9 oranında sigara dumanı/hava solutuldu. Bu sırada kontrol grubundaki sıçanlara da oda havası solutuldu. Solutma işleminin sonunda aortalar histopatolojik olarak incelendi. Element içeriği atomik absorbsiyon spektrofotometresi ile ölçüldü. Histopatolojik olarak kontrol grubu aortalarında herhangi bir patoloji gözlenilmedi. Sigara solutulan sıçanların aortalarında ise grade I ve II düzeyinde aterosklerotik bulgular saptanıldı. Sigara solutulan hayvanların aortalarında, kontrol grubuna göre demir ve kalsiyum düzeyleri anlamlı derecede yüksek bulunurken (p<0.05), magnezyum içeriği ise düşük bulundu (p<0.05). Arter duvarı demir ve kalsiyum içeriğindeki artış ile birlikte magnezyum içeriğindeki azalmanın lipid peroksidasyonu artırarak aterogenezi hızlandırabileceği düşünüldü.
Anahtar Kelimeler: Sigara dumanı, ateroskleroz, demir, kalsiyum, magnezyum, lipid peroksidasyon
SUMMARY
Element Contents and Histopathological Changes of Aorta in Smoke-Exposed Rats
To investigate possible histopathological damage and changes in trace element concentrations in aorta following cigarette smoke exposure, we exposed experimental group of rats to 10% concentration of cigarette smoke 1 hour each day for 90 consecutive days. Sham-exposed control rats were inhaled room-air under similar condition. At the end of the experiment, specimens prepared from aorta were examined histopathologically. The iron, calcium and magnesium contents of aorta were determined by using atomic absorption spectrophotometty technique. Although there was no pathological finding in sham exposed control group, grade I to II atherosclerotic degeneration was observed in all smoke-exposed animals. The iron and calcium contents of aorta were found to be significantly higher in smoke exposed rats than those of the sham exposed control (p<0.05). Magnesium contents of aorta were lower in experimental group compared to the control animals (p<0.05). It is suggested that, enhanced iron and calcium together with decreased magnesium content of artery wall following smoke exposure can promote atherogenesis by increasing lipid peroxidation.
Key Words: Cigarette smoke, atherosclerosis, iron, calcium, magnesium, lipid peroxidation
GİRİŞ
Sigara dumanının etkisinde kalan arteriyel endotelde çeşitli morfolojik değişikliklerin meydana geldiği bildirilmektedir (1). Sigara içimi ile koroner arter hastalıklarının yakın ilişkisinin bulunduğu da bilinen bir gerçektir (2). Son araştırmalarda endotel hücre hasarı ile aterosklerotik hastalıkların direkt ilişkili olduğu öne sürülmüştür. Endotelial geçirgenlik artışı aterosklerotik hastalıkların gelişiminde öncü rol oynamaktadır. Bunda da hipertansiyon, hipoksi, immün kompleksler, karbonmonoksit ve plazma kolesterol düzeyi artışı kadar sigara içimi de etkili olmaktadır (3-5).
Sigara dumanı içinde bulunan serbest radikaller endotel hasarının en büyük sorumlusudur (6). Sigara dumanı ile birlikte metal iyonları da inhale edilir (7, 8). Demir ve bakır gibi geçiş metal iyonları oksijen radikallerinin üretimine aracılık ederek endotel hasarını artırırlar (6). Oksidatif zedelenme sonucu hücre içinde serbest kalsiyum konsantrasyonunun arttığı bilinmektedir. Hücre içinde konsantrasyonu artan kalsiyum iyonu kalsiyuma bağımlı proteazları aktive ederek hücre hasarının artmasına aracılık eder. Bu nedenle serbest radikaller, metal iyonları ve hücre içinde serbestleşen kalsiyum iyonları birlikte zararlı etkiler oluşturmaktadır (9). Dolaşımda bulunan oksidan ajanlar arttığı zaman damar duvarı endotel hasarı oluşarak/ilerleyerek aterosklerozu hızlandırmaktadır (6).
Biz bu çalışmamızda uzun süre sigara dumanına maruz bıraktığımız sıçanların aortalarındaki histopatolojik değişiklikleri ve element içeriğini incelemek istedik.
MATERYAL ve METOD
10-12 haftalık 24 adet erkek Wistar sıçan rasgele iki gruba ayrıldı. Çelik kafeslerde su ve kuru hazır yem ile beslendiler. Eşit koşullarda gün ışığı alabilen temiz havalı ortamda bir hafta gözlem altında tutuldular. Yapılan gözlem sonucunda sıçanların hiçbirisinde dış muayene ile bir patoloji saptanmadı.
Deney grubundaki hayvanlara 1/9 oranında sigara dumanı/oda havası karışımı günde bir saat olmak üzere 90 gün boyunca solutuldu. Deneysel çalışmada filtresiz sigara kullanıldı ve solutma işlemi Chen ve ark.’nın tarif ettiği düzenek yardımı ile yapıldı (10). Kontrol grubuna da aynı solutma işlemi normal oda havasıyla aynı koşullar altında uygulandı.
Doksan günün sonunda her iki gruptaki toplam 24 sıçan eter anestezisi ile uyutulup, paslanmaz çelik cerrahi aletlerle, sterilizasyon kurallarına uymak koşuluyla diseke edildi ve aortaları çıkarıldı. Her aortadan bir parça patolojik inceleme için ayrılırken, kalan aorta parçalarından element analizi yapıldı.
Patolojik inceleme için ayrılan doku parçaları hemen %10’luk formaldehid ile tespit edildi. Daha sonra ototeknikon yardımı ile doku takibine alındı. Takip edilen dokular parafine gömülerek bloklandı. Mikrotom ile kesildi ve Hematoksilen Eozin ile boyanarak ışık mikroskopunda incelendi.
Element analizi için ayrılan doku parçaları ise 80˚C’de 24 saat kurutuldu. Kuruyan dokular 0.1 mikrogram düzeyinde hassas elektronik terazide tartıldı (Sartorius Basic Electrobalance, Model BA 1105, Almanya). Örnekler iyondan arındırılmış küçük cam tüplere alındı. Elementten arındırılmış HNO3 ile ön yıkama yapıldı. Sonra distile su ile yıkandı. 5/1 oranında konsantre nitrik asit/perklorik asit karışımı içine nakledildi. 140˚C’ye kadar ısıtılarak organik kısımları sindirildi. Distile su ile standart bir volüm oluşturulan tüplerin ağzı parafin film ile kapatıldı. Element incelemesi yapılana kadar +4˚C’de saklandı. Kalsiyum, magnezyum ve demir içerikleri atomik absorbsiyon spektrofotometri tekniği ile ölçüldü. Doku element içeriği mikrogram/gram kuru doku ağırlığı olarak verildi (11).
İstatistiksel analiz için Mann-Whitney U testi kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. p değeri <0.05 olanlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Aortanın histopatolojik incelemesinde deney grubundaki sıçanlarda lümenin yer yer duvar kalınlaşması nedeniyle daraldığı gözlendi (Şekil 1). Kalınlaşmanın izlendiği alanlarda boyanmanın daha soluk olduğu dikkat çekti. Tariflenen bölgede lipid yüklü makrofajlar gözlendi ve hafif derecede fibrotik reaksiyon izlendi (Şekil 2). Aynı şartlar altında sadece oda havası solutulan sıçanların aortalarında ise herhangi bir histopatolajik değişiklik saptanmadı.
Aortanın demir ve kalsiyum içeriği incelendiğinde, sigara dumanı solutulan hayvanlarda kontrol grubu hayvanlarına göre önemli derecede yükseklik bulundu (p<0.05). Aortanın magnezyum içeriği ise sigara solutulan sıçanlarda daha düşüktü (p<0.05) (Tablo 1 ).
TARTIŞMA
Aterosklerotik kalp ve damar hastalıkları batı dünyasında önde gelen mortalite ve morbidite nedenleri arasında yer aldığı için, çağımızın en önemli hastalıkları arasında bulunmaktadır. Hastalığın etyolojisinde yer alan baskın risk faktörleri arasında her yaş ve cins grubunda popülaritesini koruyan sigara içiminin de yer alması dikkat çekicidir (4).
Aterosklerozda karakteristik lezyon bir endotel tabakası ile kaplı düz kas hücreleri ve fibröz dokudan bir kep ile birlikte, sarımtırak renkte lipit içeren bir göbekten oluşmuş fibröz bir plaktır (4,12). Bu genel histopatolojik tarif esas olmak üzere, aterosklerotik lezyon hastalığın şiddetine göre değişik seviyelerde karşımıza çıkabilir. Aterosklerotik lezyonun 5 grade’e ayrılarak değerlendirilmesi olayın şiddetini açıklaması bakımından daha değerlidir (13-15). Bu çalışmada sigara dumanı solutulan sıçanların aortaları histopatolojik olarak incelediğinde aterosklerotik lezyonun, 6 olguda grade I seyiyesinde olduğu gözlenirken, 6 olguda ise grade I’i aşıp %25’den az lümen daralması ve medianın 1/3’lük kısmında gevşek bağ dokusu oluşturması ile grade II seviyesine ulaştığı tespit edildi. Normal oda havası solutulan sıçanların aortası ise lezyon izlenmeyen grade 0 seviyesindeydi. Böylelikle 90 günde ve günde bir saat gibi az bir süre sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarında grade I ve II düzeyinde aterosklerotik lezyon geliştiği histopatolojik olarak belirlendi. Etkinin devam etmesi ve şiddetinin artması halinde daha ileri grade’lerde lezyon izlenebileceği düşünüldü.
Sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarında çok sayıda lipit yüklü makrofajlar gözlendi (Şekil 2) Aterosklerotik lezyonun gelişim aşamalarında lipid yüklü makrofajların erken dönemlerden itibaren ortaya çıktıkları bilinmektedir. Bu çalışmada tarif edilen lezyon alanlarında ortaya çıkan lipid yüklü makrofajlar sigara dumanının ateroskleroz gelişimini uyarıcı etkisine kanıt oluşturmaktadır (16-18).
Kontrol grubundaki sıçanlarda bu tür değişikliklerin görülmemesi, izlenilen patolojik değişikliklerin sigara dumanı solumaya bağlı olarak geliştiğine işaret etmektedir.
Bu çalışmada sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarında demir ve kalsiyum içeriği, kontrol grubuna göre daha yüksek değerlerde bulunmuştur. Deney grubundaki sıçanların aortalarındaki magnezyum içeriği ise kontrol grubuna göre daha düşüktür (Tablo 1). Sigara dumanı çinko, bakır, demir gibi eser elementler kurşun, kadmiyum gibi ağır metalleri yüksek konsantrasyonlarda içermektedir (8). Sigaraların filtre kısmı inhale edilen metal iyonlarını önemli miktarda tutarlar. Ancak sigara ile açığa çıkan yan dumanda bu etki görülmediği için, filtresiz sigara içimi ile veya pasif sigara içici durumundakilerde, bu metal iyonlarının solunum yolu ile organizmaya girişi çok daha fazla olmaktadır (8). Çalışmamızda deney grubundaki sıçanların filtresi çıkarılmış sigara dumanını pasif olarak solumaları sağlanmıştır. Bu nedenle sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarındaki konsantrasyonları artan demirin en önemli kaynaklarından biri, inhalasyon yolu ile dolaşıma katılan serbest demir iyonları olabilir.
Sigara dumanı metal iyonlarının yanısıra oksijen serbest radikalleri, aromatik hidrokarbonlar, pestisidler gibi pekçok toksik irritan ve hücre zedelenmesine aracılık eden madde de içermektedir. Sigara dumanına maruz kalan sıçanlarda görülen endotel zedelenmesi aterosklerotik lezyonların gelişiminde anahtar rol oynamaktadır (6). Sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarında tesbit edilen yüksek kalsiyum içeriği bu endotel zedelenmesinin sonucu olabilir. Zira zedelenmiş endotelin hücre dışında yüksek konsantrasyonda bulunan kalsiyuma karşı geçirgenliğinin arttığı düşünülmektedir (9).
Magnezyum hücre içerisinde daha yüksek konsantrasyonlarda bulunan bir elementtir (19). Sigara solumaya bağlı damar duvarı zedelenmesi hücre içinden magnezyumun hücre dışına çıkışına yol açabilir. Bizim sigara dumanı solutulan sıçanların aortalarında tespit ettiğimiz daha düşük magnezyum düzeyi bu hipotezi doğrular niteliktedir. Zira magnezyum eksikliği çeken kişilerde aterosklerotik sürecin hızlandığı tespit edilmiştir (19).
Demir iyonu gibi geçiş metalleri oksijen radikallerinin üretimini uyararak hücre zedelenmesini artırmaktadır. Bu nedenle sigara dumanı solutulan sıçanlarda damar duvarında konsantrasyonu artan demir iyonları serbest oksijen radikalleri ile birlikte damar endotel hasarı oluşumuna katkıda bulunmaktadır (6). Hücre membranındaki zedelenmeyi takiben damar duvarında konsantrasyonu artan kalsiyum, kalsiyuma bağımlı proteolitik enzimlerin aktivite kazanmasına yol açarak aterosklerotik süreçte etkili olmaktadır. Magnezyum ise fizyolojik bir kalsiyum antagonistidir. Hücre içi magnezyum konsantrasyonundaki azalma da kalsiyumun etkisini uyararak, kalsiyum bağımlı proteazların aktivitesinde ve bu yolla hücre zedelenmesinde artışa aracılık etmektedir (19).
Bu çalışmada deney hayvanlarına sigara dumanı solutmanın aortadaki demir ve kalsiyum içeriğini artırırken, magnezyum içeriğini azalttığı tespit edilmiştir. Damar duvarında tespit ettiğimiz iyon değişikliklerinin hepsi hücresel hasara neden olarak aterosklerotik lezyonun gelişiminde temel oluşturabilir. Nitekim damar duvarındaki iyon değişikliklerinin, sigara solumaya bağlı damar duvarı hasarını ortaya koymadaki etkinliğini araştırmak için daha ileri düzeyde çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
KAYNAKLAR
YAZIŞMA ADRESİ:
Dr. Serdar YARDIMCI
Yüksel Cad. No: 33/14
Kızılay, ANKARA