İÇ HASTALIKLARI Dergisi 2013; 20: 141-147
KLİNİK ÇALIŞMA

Monoklonal Gamopatilerin Tanısında
Elektroforez Bulgularıyla Hafif Zincirlerin
Kantitatif Ölçüm Değerlerinin Karşılaştırılması

Comparison of Electrophoresis and Quantitative Light Chain Assays in the Diagnosis of Monoclonal Gammopathies

Uzm. Dr. Nurcan Paker1, Uzm. Dr. Atakan Yeşil2, Uzm. Dr. Sacide Atalay3

1 Düzen Laboratuvarlar Grubu, İstanbul

2 Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Gastroenteroloji Kliniği, İstanbul

3 Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Biyokimya, İstanbul

ÖZET

Giriş: Monoklonal gamopatilerin taramasında geleneksel olarak altın standart yöntemler, serum protein elektroforezi (SPE) ile serum ve idrarda immünfiksasyon elektroforezi (İFE) olmuştur. İntakt immünglobulinler, total ve serbest hafif zincirlerin (κ- ve λ-FLC) kantitatif ölçüm yöntemleri geliştirilmiştir. Bu çalışmada; bu metodların geleneksel yöntemlerle uyumu araştırıldı.

Materyal ve Metod: Altmış beş serum ve idrar örneğinde serum/idrar İFE, SPE ve total/serbest hafif zincir ölçümleriyle  monoklonal protein varlığı analiz edildi.

Bulgular: Serbest ve total hafif zincir oranları (κ/λ) İFE ile karşılaştırıldığı zaman, paraproteini saptamada, total κ/λ oranı uyumluluk, sensitivite ve spesifite açısından daha iyi performansa sahipti. Poliklonal hipergamaglobulinemi ve/veya renal bozukluğu olan hastaların serumunda yüksek κ ve λ-FLC değerleri görüldü. Ancak κ/λ oranları normaldi.  Sadece serum FLC κ/λ oranıyla, serum ve idrarda İFE bulguları karşılaştırıldığında; 25 hasta arasında serum ve/veya idrar İFE bulgusu pozitif olan15 hastadan 12'si sadece serum İFE ile (sensitivite; %80.0), 13'ü sadece FLC ölçümleriyle (sensitivite; %86.6) tespit edilebilirdi. İdrar çalışması olmadan, serum İFE ve FLC bulgularının kombine edilmesi durumunda 25 hasta için duyarlılık %100 ulaşmaktadır.

Sonuç: SPE, serum ve idrar İFE bulgularıyla serum FLC (κ ve λ) ve total hafif zincirleri (κ ve λ) ölçümleri karşılaştırıldığında; monoklonal gamopatilerin tespitinde hiçbir testin tek başına elektroforetik testlerin yerini alamayacağı görüldü. İdrar İFE, olmadan sadece serum İFE'de negatif bulgunun yeterli olmadığı da tespit edildi.

Anahtar Kelimeler: Monoklonal gamopati, monoklonal protein, immünfiksasyon, serum protein elektroforezi, serbest hafif zincir, total hafif zincir

SUMMARY

Introduction: In screening for monoclonal gammopathies, the gold standard methods have conventionally been SPE and IFE in serum and urine. Quantitative measurement methods were developed for intact immunoglobulins and total and free light chains (κ ve λ). In this study, the consistence of these methods with conventional methods was investigated.

Materials and Methods: Sixty five samples of serum and urine was analysed for the presence of monoclonal protein using standard serum/urine IFE, (SPE) and measurement of total and free light chain.

Results: When free and total light chain ratios (κ/λ) were compared with IFE, total κ/λ ratio had better performance in terms of consistence, sensitivity and specificity in detecting paraproteinemia. High values of κ and λ-FLC were seen in serums of patients with polyclonal hypergammaglobulinemia and/or renal dysfunction. However, κ/λ ratios were normal. When only serum FLC κ/λ ratio were compared with IFE findings in serum and urine, of 25 patients, among which 15 had positive serum and/or urine IFE finding, 12 were detected with only serum IFE (sensitivity; 80.0%) and 13 were detected with only FLC measurements (sensitivity; 86.6%). Without urine investigation, monoclonal immunoglobulinemia may have been determined with 100% sensitivity by combination of serum IFE and FLC measurements.

Conclusion: When SPE and serum and urine IFE findings were compared with serum FLC (κ and λ) and total light chains (κ and λ) measurements, it was seen that no one test alone can be used to replace electrophoretic tests in determining monoclonal gammopathies. It was also found that obtaining a negative result in only serum IFE is not enough without urine IFE.

Key Words: Monoclonal gammopathy, monoclonal protein, immunofixation, serum protein electrophoresis, free light chain, total light chain

GİRİŞ

Paraproteinemiler veya disproteinemiler olarak da bilinen monoklonal gamopatiler, farklılaşmış B lenfositlerin (plazma hücreleri) bir veya daha fazla klonun çoğalmasıyla karakterize bir grup hastalıktır. Bu hastalık grubunda paraprotein veya monoklonal (M) protein olarak bilinen, immünolojik olarak homojen immünglobulin üretimi ortak bulgudur. Dolaşımdaki M-proteini intakt immünglobulin olabildiği gibi sadece hafif zincir veya nadiren de olsa sadece ağır zincir olabilir (1).

Monoklonal gamopatiler, klinik anlamı belirlenmemiş monoklonal gamopati (monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)'den potansiyel olarak tedavi edilebilir soliter plazmasitoma, hayatı tehdit eden multipl miyelomu ve hafif zincir amiloidoz kadar bir grup hastalığı kapsar. Bu hastalıkların her biri için dolaşımdaki monoklonal immünglobulinlerin ölçümü tanı, tedavi ve takip açısından önemlidir. 1990 yıllarına kadar monoklonal gamopatilerin tanımlanmasında serum protein elektroforezi (SPE), immünelektroforezi (İEF), immünfiksasyon elektroforezi (İFE) ve serumda immünglobulin ağır zincirlerin nefelometrik ölçümü kullanılmaktaydı. MGUS ve multipl miyelom hastalarının çoğu için, bu ölçümler yeterli sayılabilir; ancak amiloidoz olan hastaların çoğunluğu ve nonsekretuar veya oligosekratuar miyeloma hastalarının %3'ten fazlası için yetersiz kalmaktadır (2).

2001 yılında ticari olarak (The Binding Site, İngiltere) serbest immünglobulin hafif zincir (κ ve λ) bileşenleri için immünolojik ölçüm (nefelometrik ve türbidimetrik) kitleri piyasaya sunulmuştur (3). κ ve λ serbest hafif zincirlerin kantitatif ölçümleri yanında, serbest κ/λ oranları serbest hafif zincir (free light chain, FLC) veya "Freelite" olarak bilinmektedir. FLC ölçümünün nonsekretuar miyelom ve amiloidoz tanısında daha erken pozitif bulgu verdiği ve serbest hafif zincir hastalığının izlenmesinde daha yararlı olabileceği rapor edilmiştir (4,5,6,7,8).

Bu çalışmada amaç; monoklonal gamopatilerde kullanılan İFE, serumda total hafif zincir (κ, λ) ve serumda serbest hafif zincir (κ, λ) ölçüm testleri arasındaki sonuçların uyumunu karşılaştırmaktır. Uygulanması daha az pratik ve özel ekipman gerektirdiği halde tanıda altın standart olan İFE'ye; serumda total ve serbest hafif zincir (κ ve λ) ölçümlerinin alternatif olup olmayacağıyla ilgili bilgi edinmektir.

MATERYAL ve METOD

SB Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Biyokimya Laboratuvarına İFE ve SPE testleri istemiyle gönderilen 65 ardışık serum çalışmaya dahil edildi. Serumlar serbest hafif zincir (κ- ve λ-FLC) ve total hafif zincir (total κ ve λ) düzeyleri ölçülmek üzere, iki porsiyona bölünerek, -20ºC'de bekletildi. Çalışmanın ikinci bölümü için serum FLC ve idrar İFE bulgularının birbiriyle uyumunu tespit etmek amacıyla idrar İFE istenen 25 hasta serumu seçildi. Bu çalışmaya dahil edilen bütün örnekler için klinik bilgi kullanılmadı. Ölçülen parametreler klinik değerlendirmenin bir parçası olduğundan etik kuruldan onay alınmasına gerek görülmedi.

Elektroforetik Testler

Agaroz jel yöntemiyle yarı otomatize SAS-1Plus/SAS-2/Platinum cihazında (Helena Biosciences, Tyne ve Wear, İngiltere) üretici firmanın talimatına uyularak çalışıldı.

Serum Kappa ve Lambda Serbest Hafif Zincirlerin Ölçümü

FREELITE™ (The Binding Site, Birmingham, İngiltere) reaktifiyle otomatize nefelometri cihazında (BN ProSpec, Dade Behring, Almanya) yapıldı. Her iki test için, üreticinin belirttiği şekilde standart olarak 1/100 dilüsyon ile çalışıldı. "Antijen fazlası" tespit edildiğinde daha yüksek dilüsyon ile (1/400 ve 1/2000) ölçüm tekrarlandı.

FLC için üretici tarafından belirlenmiş referans aralıklarından faydalanıldı. Bu aralıklar:

κ-FLC için, 3.30-19.40 mg/L; λ-FLC için 5.70-26.30 mg/L; serbest- κ/λ  oranı için 0.26-1.65'tir.

Serum Total Kappa ve Lambda Hafif Zincirlerin Ölçümü

İmmünotürbidimetrik olarak Modüler Sistem  (Roche Diagnostics, Almanya) analizöründe ölçüldü.

Total κ ve λ hafif zincirleri için üretici tarafından belirlenmiş referans aralıklarından faydalanıldı. Bu aralıklar:

Total-κ için 1.38-3.75 g/L; Total-λ için 0.93-2.42 g/L; Total κ/λ  oranı için 1.17-2.93'tür.

İstatistiksel Değerlendirmeler

Tanı testlerinin değerlendirilmesinde sensitivite, spesifite, PPV, NPV ve uyumluluk yüzdesi hesaplanmıştır.

BULGULAR 

Altmış beş hasta serumunda İFE uygulandı.  Bunlardan 20 hasta serumunda monoklonal protein (M-protein) saptandı. Bu M-protein bulgularının dağılımı Tablo 1'de verilmektedir.


Tablo 1

Elde edilen tüm veriler standart İFE yöntemiyle karşılaştırıldı.

İFE ile κ-tipi monoklonal protein olan 12 serumun, 9'unda anormal total-κ değeri 6'sında anormal λ-FLC görüldü. On iki hastadan sadece 9'unda anormal total-κ/λ oran, 6'sında anormal serbest-κ/λ oranı (%50.0) görüldü (Tablo 2).


Tablo 2

İFE ile λ-tipi monoklonal protein olan 8 serumun, tamamı hem anormal total-λ değeri hem de anormal λ-FLC gösterdi. Anormal total-κ/λ oranı ise, 8 hastadan 6'sında görüldü. Anormal serbest-κ/λ oranı ise, 8 hastadan sadece 5'inde  görüldü (Tablo 3).


Tablo 3

İFE uygulanan 65 hastanın serumunda serbest ve total κ-hafif zincir ölçümü referans aralığın üzerindeki değerler "anormal" kabul edilerek, İFE bulgularıyla uyumluluk, sensitivite, spesifite, PPV ve NPV değerleri tespit edildi. Standart serum İFE metoduyla karşılaştırıldığı zaman total-κ ve total-λ için uyumluluk sırasıyla %76.9 ve %89.2 bulundu. κ-FLC ve λ-FLC için uyumluluk sırasıyla %61.5 ve %67.7 bulundu. Bu verilerin serum İFE sonuçlarıyla uyumu Tablo 4'te görülmektedir.


Tablo 4

Poliklonal hipergamaglobulinemi ve/veya renal bozukluğu olan hastalarda κ ve λ-FLC değerlerinde sıklıkla artışlar görülebildiğinden, serum kreatinin düzeyi yüksek olan 14 serum ile SPE'de poliklonal artış gösteren 7 serumda yüksek κ ve/veya λ- FLC değeri görüldü. Çalışmanın ikinci bölümünde, serum FLC ve idrar İFE bulgularının birbiriyle uyumunu tespit etmek amacıyla idrar İFE istenen 25 hasta serumuna ait verileri incelediğimizde; İdrar İFE'si pozitif olan 10 hastanın tamamında bulunan hafif zincirle uyumlu anormal κ/λ oranı vardı. Yirmi beş hasta arasında serum ve/veya idrar İFE bulgusu pozitif olan 15 hastadan 12'si sadece serum İFE ile (sensitivite; %80.0), sadece FLC ölçümleriyle (sensitivite; %86.6) tespit edilebilirdi. Serum İFE'si negatif, idrar İFE'si pozitif olan 3 hasta vardı ve bu 3 serumun κ/λ oranı anormaldi. İdrar çalışması olmadan, serum İFE ve FLC bulgularının kombine edilmesi durumunda 25 hasta için duyarlılık %100'e ulaşmaktadır. 

TARTIŞMA ve SONUÇ

Monoklonal gamopatilerin taramasında geleneksel olarak altın standart yöntemler, SPE ile serum ve idrarda İFE olmuştur. Multipl miyelom, amiloidoz ve ilişkili monoklonal gamopatilerden şüphelenilen hastalar için tavsiye edilen laboratuvar algoritmalarında hem serum hem de idrar PE ve İFE yapılması önerilir (9). Serum ve idrar örneklerinde elektroforetik tekniklerle monoklonal proteinin varlığını görmek, klonaliteyi tanımlamak ve monoklonal proteinlerin ağır ve/veya hafif zincir tipini tanımlamak duyarlı ve güvenilirdir. Ancak bu yöntemlerin kantitatif yöntemler olmaması dezavantaj teşkil eder. Serbest hafif zincirlerin kantitatif serum ölçümlerinin piyasaya sunulmasıyla, monoklonal gamopatiler için tanımlanan laboratuvar test stratejilerinde duyarlılık artmıştır (3,10,11). Bu artmış tanısal sensitivite, serum ve idrar PE-İFE sonuçları normal olan veya zor fark edilebilen nonsekretuvar multipl miyelom, amiloidoz ve hafif zincir depolama hastalığında gösterilmiştir (6,7,11).

2001 yılından itibaren serum FLC ölçümlerinin pazara sunulmasını takiben, monoklonal gamopatilerde klinik tanı ve tedavideki önemiyle ilgili özellikle Bradwell ve Katzmann çalışma grupları çok sayıda çalışma yapmışlardır (3,11,12,13). Bu literatürlerde FLC'nin monoklonal gamopatilerin tanı ve tedavisinin izleniminde gittikçe sağlamlaşan bir yeri olduğu savunulmaktadır. Katzmann ve arkadaşları monoklonal gamopati tanısı almış 1020 olgunun verilerini incelediklerinde; amiloidoz olan 110 olgunun serum İFE ve serum FLC kombinasyonuyla 109'unda tanı ile uyumlu sonuç alındığı halde; sadece serum İFE ile %69; sadece serum FLC ile %91'inde pozitif monoklonal protein bulgusu bildirilmiştir (12). Monoklonal gamopatilerin tanı ve tedavi izleniminde Katzmann ve Bradwell'in çalışma grubunun genel önerileri serum İFE ve serum FLC kombinasyonunun kullanımıdır (10,12,13). Öte yandan, Beetham ve arkadaşları monoklonal gamopati tanısı almış olgularda, serumda sadece anormal FLC κ/λ oranın, sensitivitesini %76, spesifitesini %96, pozitif prediktif değeri %59 ve negatif prediktif değeri %98 olarak bildirmişlerdir ve henüz idrarda Bence Jones proteinin ölçümünden vazgeçmek için erken olduğu yorumunu yapmışlardır (14). Bu çalışmada, sadece serum FLC κ/λ oranıyla, serum ve idrarda İFE bulgularını karşılaştırdığımızda; idrar çalışmaları yapılmadan monoklonal immünglobulinlerin sadece serum İFE ile %80.0 duyarlılıkla, sadece FLC ölçümleriyle %86.6 duyarlılıkla tespit edilebileceği görüldü. Serum İFE'si negatif, idrar İFE'si pozitif olan üç hasta vardı ve bu 3 serumun κ/λ oranı anormaldi. Eğer idrar çalışmaları olmadan, serum İFE ve FLC çalışmalarının kombinasyonuyla monoklonal immünglobulin %100 duyarlılıkla tespit edilebilirdi. Bu yönüyle bulduğumuz sonuçlar Katzmann ve Bradwell çalışma gruplarının bulgularıyla uyumluydu. Ancak bu çalışmada olgu sayısı azdı ve klinik tanı doğrulaması yapılmadı. Bu yüzden, serumda veya idrarda İFE ile monoklonal hafif zincir tespit edilen her durumda, serum FLC ölçümlerinin genellikle pozitif saptanacağını söyleyemeyiz. Öte yandan, Jaskowski ve arkadaşları Freelite ölçümlerinde serbest hafif zincirinin (κ veya λ) türü ve miktar tayini yanısıra, ağır ve hafif zincirden oluşan monoklonal proteinemi (intakt immünglobulin) olan olgularda sıklıkla üretilen aşırı FLC'nin de tespit edilebileceğini bildirmişlerdir (15). SPE, serum İFE ve serum FLC uygulanan 483 olguda yaptıkları retrospektif değerlendirmelerinde; serum FLC ölçümlerini standart İFE metoduyla karşılaştırarak κ-FLC ve λ-FLC için uyumluluk, sensitivite ve spesifite yüzdelerini sırasıyla: %94.6; 72.9; 99.5 ve  %98.5; 91.4; 99.7 olarak rapor etmişlerdir (15). κ ve λ-FLC ölçümlerinin İFE'den daha az duyarlı olduğunu; fakat serumda monoklonal proteinlerin tespitinde spesifik olduğu sonucuna varmışlardır. Bu çalışmada, serbest ve total hafif zincir oranlarının (κ/λ) IFE ile karşılaştırıldığı zaman, paraproteini saptamada, total κ/λ oranı uyumluluk, sensitivite ve spesifite açısından daha iyi performansa sahipti (Tablo 4). Poliklonal hipergamaglobulinemi ve/veya renal bozukluğu olan hastaların serumunda artmış sentez veya azalmış renal klirense bağlı olarak yüksek κ ve λ-FLC değerleri görüldü. Ancak κ/λ oranları normaldi. Bu bulgu, literatürle uyumluydu (10,11). Tüm bu bilgiler ışığında, Beetham ve arkadaşlarının yorumladıkları gibi, idrar İFE ölçümünden vazgeçmenin erken olduğu düşünülebilir (14). Bu ve başka diğer çalışmalardan elde edilen sonuçlar tarama amaçlı olarak amiloidoz dışında bütün tanılarda monoklonal proteinler için 24 saatlik idrar İFE yerine, serumda FLC ölçümü kullanılabilir (2,13). Monoklonal gamopati tanısını kesinleştirmek üzere 24 saatlik idrarda İFE yapılmış olmalıdır.  Ancak amiloidoz taramaları için idrar İFE, serum FLC'yi kapsayan serum testleriyle beraber yapılmış olmalıdır (13).

Sonuç olarak, SPE, serum ve idrar IFE bulgularıyla serum FLC (κ ve λ) ve total hafif zincirlerin (κ ve λ) ölçüm düzeyleri karşılaştırıldığında; monoklonal gamopatilerin tespitinde hiçbir testin tek başına elektroforetik testlerin yerini alamayacağı görüldü. İdrar İFE, olmadan sadece serum İFE'de negatif bulgunun yeterli olmadığı da tespit edildi. Monoklonal gamopatiden şüphelenilen hastada tarama amaçlı olarak Şekil 1'deki protokolü önerebiliriz. Total ve serbest hafif zincirleri, en iyi durumda sadece paraproteinin varlığı ve hafif zincirin tipi hakkında bilgi verebilir. Hem ağır hem de hafif zincirin tipinin saptanması için mutlaka İFE gereklidir.


Şekil 1

KAYNAKLAR

  1. Gupta S, Comenzo RL, Hoffman BR, Fleisher M. National Academy of Clinical Biochemistry Guidelines for the Use of Tumor Markers in Monoclonal Gammopathies. Section 3:K. www.aacc.org, 2005.
  2. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, Miguel JS, Ludwig H, Hajek R, et al.; International Myeloma Working Group. International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia 2009; 23:  215-24.
  3. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT, et al. Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin Chem 2001; 47: 673-80.
  4. Abraham RS, Katzmann JA, Clark RJ,  Bradwell AR, Kyle RA, Gertz MA. Quantitative analysis of serum free light chains. A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am J Clin Pathol 2003; 119: 274-8.
  5. Carr-Smith HD, Drayson MT, Bradwell AR. Development of serum free light chain immunoassays for the detection and monitoring of patients with Bence Jones myeloma. Clin Chem 2001; 47: A33.
  6. Drayson M, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith HD, Bradwell AR. Serum free light-chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory multiple myeloma. Blood 2001; 97: 2900.
  7. Lachmann HJ, Gallimore RJ, Gillmore D, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB, et al. Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating free immunoglobulin light chains following chemotherapy. Br J Haematol 2003; 122: 78-84.
  8. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA, Bradwell RA. Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Br J Haematol 2004; 126: 348-54.
  9. International Myeloma Working Group. Criteria for the classification of monoclonal gammopathies, multiple myeloma and related disorders: a report of the International Myeloma Working Group. Br J Haematol 2003; 121: 749-57.
  10. Bradwell AR. Serum free light chain measurements move to center stage. Clin Chem 2005; 51: 805-7.
  11. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell AR, et al. Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin Chem 2002; 48: 1437-44.
  12. Katzmann JA, Abraham RS, Dispenzieri A, Lust JA, Kyle RA. Diagnostic performance of quantitative κ and λ free light chain assays in clinical practice. Clin Chem 2005; 51: 878-81.
  13. Katzmann JA, Dispenzieri A, Kyle RA, Snyder MR, Plevak MF, Larson DR, et al. Elimination of the need for urine studies in the screening algorithm for monoclonal gammopathies by using serum immunoŞxation and free light chain assays. Mayo Clin Proc 2006; 81: 1575-8.
  14. Beetham R, Wassell J, Wallage MJ, Whiteway AJ, James JA: Canserum free light chains replace urine electrophoresis in the detection of monoclonal gammopathies? Ann Clin Biochem. 2007; 44: 516-22.
  15. Jaskowski TD, Litwin CM, Hill HR. Detection of κ and λ light chain monoclonal proteins in human serum: automated immunoassay versus immunoixation electrophoresis. Clin Vaccine Immunol 2006; 13: 277-80.

Yazışma Adresi:

Uzm. Dr. Nurcan Paker

Düzen Laboratuvarlar Grubu,

İstanbul

E-posta: nurcanpaker@gmail.com

Yazdır